Estudo comparativo da viabilidade de ovário criopreservado por congelamento lento e vitrificação em ratas / Comparative study of ovarian cryopreservation by slow freezing and vitrification in mice

INTRODUÇÃO: A criopreservação de células e tecidos germinativos objetiva proteger o potencial fértil em pacientes submetidas a tratamentos que induzam à infertilidade. Objetivo: Comparar congelamento lento e vitrificação de tecido ovariano e verificar o tipo folicular com maior viabilidade no tecido criopreservado. MATERIAL E MÉTODOS: 58 ratas tiveram seus ovários ressecados, dissecados e fragmentados e divididos em dois grupos: A (27 ratas): criopreservados por congelamento lento; e B (31 ratas) - vitrificados. As amostras foram submetidas à avaliação histológica geral pela coloração com H/E, e à avaliação imunohistoquímica com anti-Ki-67. RESULTADOS: Para análise estatística, os testes paramétricos Qui-quadrado de Student e o teste não-paramétrico de Wilcoxon, com nível de significância de 5% (p menor que 0,05). No momento 0 todas as amostras de ambos os grupos apresentaram histologia normal. Após a criopreservação, todas as amostras do Grupo A apresentaram alterações histológicas em diferentes níveis e, em 55,6% dos fragmentos houve sinais de necrose. Das amostras do Grupo B, 22,6% apresentaram alterações histológicas reversíveis e não houve necrose. A análise imunohistoquímica demonstrou que, na comparação entre os momentos, com relação à positividade para o Ki-67 em folículos primordiais, somente foi observada diferença significativa para o Grupo B. No momento 1, o Grupo B apresentou diferença significativa para a marcação em folículos primordiais (p igual a 0,026) e probabilidade limítrofe em folículos primários (p igual a 0,082). CONCLUSÃO: A vitrificação demonstrou menor grau de degeneração tissular e maior índice de viabilidade folicular. Folículos primordiais são os que apresentam maior viabilidade após a criopreservação

Marcador KI-67 como índice preditivo da viabilidade de ovário criopreservado por congelamento lento e vitrificação em ratas / Ki-67 marker used as a predictive index of the viability of cryopreserved ovaries through slow freezing and vitrification in rats

Avaliar duas técnicas de criopreservação de tecido ovariano: congelamento lento e vitrificação, por meio de marcação imunohistoquímica com anticorpo primário anti ki 67 e verificar o tipo folicular mais resistente à criopreservação. 58 ratas foram submetidas à ooforectomia bilateral e divididas em dois grupos: A: 27 ratas cujos fragmentos ovarianos foram criopreservados com a técnica de congelamento lento e B: 31 ratas cujas secções ovarianas foram criopreservadas por vitrificação. Amostras do tecido foram submetidas à avaliação imunohistoquímica com e observaram-se células foliculares positivas para o marcador. Analisaram-se os fragmentos no momento 0 (dia da ooforectomia) como controle e no 43 dia após esse procedimento, momento 1. Na comparação significativa para marcação em folículos primário e secundário, para ambos os grupos. Na comparação entre os grupos não foi observada diferença significativa no momentoO. No momento 1, o Grupo B apresentou diferença significativa para a marcação em folículos primordiais (p=0,026), ou seja, houve um número maior de amostras Ki67 positivas nesse grupo. A marcação com Ki67 demonstrou que, embora ambos os métodos de congelamento ovariano resultem em tecidos potencialmente viáveis, a vitrificação manteve maior número de folículos primordiais potencialmente funcionantes, podendo ser considerada melhor técnica de criopreservação de tecido ovariano do que o congelamento lento, em ratas. Os folículos primordiais são os que melhor resistem ao processo de criopreservação, tanto por congelamento lento como por vitrificação.

Aspectos histológicos do ovário de coelhas após criopreservação / Histological aspects of rabbit ovarian tissue after cryopreservation

OBJETIVO: avaliar a preservação folicular e as características celulares do tecido ovariano criopreservado, em coelhas. MÉTODOS: fez-se, sob anestesia, a ooforectomia direita de dez coelhas brancas, adultas. Dissecou-se o ovário mantendo-se o córtex com espessura de 1,5 milímetros. Fragmentou-se o tecido em pequenas secções, algumas para o estudo histológico de controle e outras destinadas à criopreservação pelo protocolo de congelamento lento. Passadas seis semanas efetuou-se o descongelamento e fez-se a avaliação histológica. As amostras do controle e do experimento, após processamento, foram coradas pela hematoxilina-eosina para identificação dos aspectos histológicos e submetidas à técnica imuno-histoquímica utilizando-se o PCNA (proliferating cell nuclear antigen) para a avaliação da viabilidade celular. Utilizaram-se os testes não paramétricos "comparação entre duas proporções" e Mann-Whitney e o teste paramétrico t de Student. RESULTADOS: observou-se que no tecido criopreservado só persistiram oócitos primordiais. Entre as alterações reversíveis identificaram-se: vacuolização citoplasmática em todas as amostras (p=0,039), lise estromal em 50 por cento (p=0,648) e oócitos com contornos irregulares em 80 por cento (p=0,007). Encontraram-se alterações irreversíveis como degeneração hialina e picnose em 30 por cento das amostras (p=0,210). A análise imuno-histoquímica demonstrou os folículos, em diferentes estágios de desenvolvimento, no tecido não congelado e folículos primordiais no tecido criopreservado com positividade para o PCNA, indicando a presença de DNA ativo. CONCLUSAO: no tecido ovariano criopreservado sobrevivem apenas os folículos primordiais; existem alterações histológicas reversíveis (vacuolização citoplasmática, lise estromal, fragmentação das células da granulosa e oócitos com contornos irregulares); alterações irreversíveis, em níveis não significantes (degeneração hialina e picnose) e presença de PCNA positivo em todos os folículos.

PCR em embriöes bovinos: proposiçäo de modelos de treinamento / PCR in bovine embryos: proposition for a training model

Objetivo: Desenvolver um protocolo animal de treinamento para equipe interessada em adquirir conhecimentos e destreza técnica no manuseio de embrioes com finalidade de realizar diagnóstico pré-implantaçao através da técnica de reaçao em cadeia da polimerase (PCR). Métodos: Realizamos procedimentos, com retirada dos ovários de vacas em abatedouro, sem qualquer critério de escolha das mesmas. Os ovários após serem assépticamente retirados foram levados em cuba estéril para laboratório de fertilizaçao. Os folículos com diâmetro inferior à 8 mm foram puncionados com seringa descartável de 10 ml e agulha 21 G. Os ovócitos retirados do líquido folicular sob microscópio estereoscópio foram lavados em soluçao salina tamponada (D-PBS) e transferidos para placas "Nunc" contendo meio de cultura para maturaçao. Os ovócitos obtidos, separados para o estudo após 24 horas de maturaçao, foram fertilizados com aproximadamente 1.000.000/ml de espermatozóides e mantidos em cultivo em meio de fertilizaçao. Após fertilizados, foram transferidos para placas de co-cultura com células vero, e mantidos em incubadora com 5 por cento de C02, 20 por cento de oxigênio e 75 por cento de nitrogênio a 37º C e umidade de 90 por cento, por cinco dias. Após este período, separamos os embrioes com 8 ou mais blastômeros, aleatoriamente, em dois grupos. Um deles foi mantido em cultivo com o mesmo meio e mesmas condiçoes para servir como grupo controle, o outro foi submetido à biópsia. Após abertura da zona pelúcida, retiramos 1 ou 2 blastômeros dos embrioes, com a utilizaçao de microscópio invertido e equipamento de micromanipulaçao. Em seguida à biópsia, os embrioes permaneceram em co-cultura por mais três dias. Ao final deste tempo, avaliamos o desenvolvimento comparativamente com o grupo controle. Foi realizado estudo morfológico dos embrioes até o estágio de blastocisto ou extrusao da zona pelúcida (hatching), identificando o fenômeno de cavitaçao e estreitamento da zona pelúcida, e contagem do número de células através de coloraçao específica para núcleos com o intuito de comprovar a inocuidade da biópsia. Cinqüenta embrioes e seus blastômeros biopsiados foram submetidos a reaçao em cadeia da polimerase para identificaçao do sexo. Resultados: Dos 57 embrioes biopsiados, 40 atingiram o estágio de blastocisto, (70,2 por cento) e em 11 foi observado o "hatching" (27,5 por cento). Nos embrioes co-cultivados para controle foram obtidos...(au)

Cultura de embriöes até o estágio de blastocisto: comparaçäo entre o uso de meios seqüenciais e de co-cultura / Embryo culture to blastocyst stage: comparison using sequential medium and coculture

Objetivos: comparar o desenvolvimento embrionário entre o uso de dois métodos diferentes de cultura (meio seqüencial ou co-cultura em células Vero). Métodos: foram incluídas 110 pacientes que tiveram ovócitos aspirados e submetidos à fertilizaçäo in-vitro. Metade das pacientes teve seus embriöes cultivados juntamente com células Vero e a outra metade em meio seqüencial G1:2/G2:2. Os embriöes foram transferidos no dia 5 pós-fertilizaçäo, após avaliaçäo morfológica, verificando-se a taxa de blastulaçäo. A gravidez foi definida por meio de ultra-sonografia, verificando-se batimento cardíaco após a 13ª semana pós-transferência. Resultados: a taxa de blastocistos expandidos encontrada em nosso estudo foi de 15,9 por cento e 14 por cento com células Vero e G1:2/G2:2, respectivamente. Com células Vero 36,0 por cento das pacientes engravidaram com taxa de implantaçäo de 18,9 por cento. Quando se utilizou G1:2/G2:2 as taxas de gravidez e implantaçäo foram 28,9 por cento e 14,9, por cento, respectivamente. Em apenas 17 casos obtiveram-se blastocistos após co-cultivo em células Vero, apresentando 76,5 por cento de taxa de gravidez e 63,0 por cento de implantaçäo. Quando o cultivo foi em G1/G2 21 pacientes apresentaram blastocistos e as taxas de gravidez e implantaçäo foram de 57,1 e 76,0 por cento, respectivamente. Conclusäo: näo houve diferença significativa entre as taxas de gravidez ou implantaçäo nos 2 tipos de cultivo. Nos casos em que blastocistos expandidos foram transferidos, as taxas de implantaçäo e gravidez aumentaram com ambos os tipos de cultivo. Nestas pacientes, independente do tipo de cultivo utilizado, um número maior de ovócitos foi obtido, o que nos leva a pensar que näo apenas as condiçöes de cultura influenciam as taxas de implantaçäo e gravidez, mas a qualidade dos óvulos também é importante, pois as "boas respondedoras" tiveram melhores resultados.

Avaliaçäo do desenvolvimento de embriões bovinos pós-biópsia: um modelo para treinamento / Evaluation of the post-biopsy development of bovine embryos: proposal of a training model

Objetivo: montar um protocolo animal para estudo e treinamento em biópsia embrionária. Métodos: ovários de vaca obtidos em abatedouro eram transportados ao laboratório onde os oócitos aspirados eram maturados. Posteriormente eram submetidos à fertilizaçäo in vitro. No dia 5 pós fertitizaçäo, os embriões eram biopsiados, com a abertura da zona pelúcida realizada mediante lâmina de corte ajustada ao microscópio óptico. Após abertura da zona pelúcida 1 ou 2 blastômeros eram removidos dos embriões. Após a biópsia, os embriões permaneciam em co-cultivo por mais três dias. Ao final deste tempo, o desenvolvimento dos embriões era avaliado e comparado ao do grupo controle por meio de estudo morfológico e contagem do número de células, usando coloraçäo específica para núcleos. Resultados: dos 57 embriões biopsiados, 40 atingiram o estágio de blastocisto (70,2 por cento) e em 11 foi observado o "hatching" (27,5 por cento). No grupo controle obtiveram-se 42 blastocistos (73,7 por cento) e, destes, 11 chegaram a "hatching" (26,2 por cento). Após contagem do número de células, observou-se que näo houve diferença estatisticamente significante entre os 2 grupos. Conclusäo: podemos verificar por meio dos resultados que o protocolo proposto foi tecnicamente viável, além de fornecer bom número de embriões, pela facilidade de obtençäo de oócitos bovinos, podendo ser adotado para treinamento

Co-cultura de embriões humanos em células vero e transferência em fase de blastocisto / Human embryo coculture in vero cells and blastocyst stage transfer

Objetivos: determinar se o dia da transferência ou o estágio em que o embriäo é transferido interferem nas taxas de gravidez e implantaçäo. Métodos: cento e sete pacientes tiveram seus oócitos aspirados e submetidos à fertilizaçäo in vitro. Os embriões foram co-cultivados em células Vero e transferidos no dia 3 ou dia 5 pós-fertilizaçäo, após avaliaçäo morfológica. Resultados: a taxa de implantaçäo dos embriões transferidos no dia 5 foi significativamente maior que quando os embriões eram transferidos no dia 3, mas as taxas de gravidez näo variaram. Observou-se uma diferença significativa nas taxas de gravidez quando se comparou o estágio em que o embriäo era transferido, obtendo-se 70,6 por cento de gravidez quando se transferiram blastocistos expandidos e 20 por cento e 10,5 por cento quando eram transferidos blastocistos iniciais ou mórulas, respectivamente. Conclusões: as taxas de implantaçäo e gravidez säo significativamente aumentadas quando se transferem embriões em estágio de blastocisto expandido, mas os meios e condições de cultura de que dispomos no momento ainda säo insuficientes para nos fornecer uma taxa satisfatória de embriões neste estágio

Controle de qualidade e treinamento técnico com embriöes bovinos para laboratórios de FIV / IVF laboratory quality control and staff training through the development of bovine embryos

Com o intuito de investigar um controle de qualidade eficiente e de baixo custo para o laboratório de fertilizaçäo in vitro (FIV), além de treinar adequadamente o pessoal envolvido no trabalho, desemnvolvemos uma técnica de controle de qualidade através de embriöes bovinos. Seiscentos e vinte e dois oócitos bovinos foram aspirados de ovários de vaca, retirados imediatamente após a morte em frigorífico. Observou-se que, após a fertilizaçäo in vitro, 373 oócitos apresentavam divisäo em diversos estágios de desenvolvimento até mórula. Comparando-se com o controle de qualidade através de embriöes de camundongo, que é o método adotado internacionalmente nos laboratórios de FIV, observou-se eficácia similar, além de menor custo com relaçäo às técnicas e condiçöes de cultura

Colheita de oócitos em ambulatório / Oocyte recovery in outpatients

Estimated 14 oocytes recoveries in 12 patients between 22 to 38 years of age and 45 to 75Kg weight has been done with endovaginal ultrasound. Local paracervial anesthesia using 400mg of xylocaine 2 per cent without vasoconstrictor and induction and maintenance with propofol (Diprivan) IV 110 to 250mg were performed; in two patients 50 mg of tiophental was used too. Seven patients used clomiphene citrate, HMG and HCG, and seven patients used leuprolide acetate, HMG and HCG. There was not ever more than two hours.